實(shí)驗(yàn)過(guò)程：細(xì)胞生物學(xué)和蛋白質(zhì)純化
在執(zhí)行所設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，需要使用所有工具來(lái)可靠操作。無(wú)論您是在執(zhí)行時(shí)間過(guò)程實(shí)驗(yàn)、分析蛋白質(zhì)表達(dá)，還是在細(xì)胞培養(yǎng)中進(jìn)行任何其它實(shí)驗(yàn)，所有工具都必須完美配合，以輸出可信賴的數(shù)據(jù)。
為了幫助您將想法轉(zhuǎn)化為真知灼見(jiàn)，我們提供了一系列細(xì)胞培養(yǎng)工具和技術(shù)，以助您完成實(shí)驗(yàn)和獲取可信賴的數(shù)據(jù)。
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濃縮與透析
如果您培養(yǎng)細(xì)胞的目的是純化蛋白質(zhì)，那么您一天的大部分時(shí)間都花費(fèi)在過(guò)濾、提純和濃縮蛋白質(zhì)上。長(zhǎng)時(shí)間純化實(shí)驗(yàn)期間，蛋白質(zhì)可能在任何一步驟發(fā)生降解、沉淀或損失，因此，這些步驟將成為一大挑戰(zhàn)。選擇正確的工具可以提高效率，減少純蛋白和濃縮蛋白損失的幾率。
實(shí)驗(yàn)中的每一步都可能減少您的蛋白產(chǎn)量：
- 細(xì)胞裂解期間的蛋白降解。細(xì)胞裂解和澄清上清液可能需要數(shù)小時(shí)，蛋白接觸蛋白酶可能會(huì)被截短或完全降解。
- 濃縮期間變干。成功完成純化步驟后，濃縮似乎變得瑣碎又無(wú)足輕重。但在未采取必要預(yù)防措施情況下，過(guò)快地旋轉(zhuǎn)樣品或旋轉(zhuǎn)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，就可能在蛋白濃縮器中丟失蛋白。
- 透析期間的泄露。在長(zhǎng)時(shí)間、多個(gè)步驟的透析期間，蛋白可能從透析袋或透析盒中泄露。特別是在持續(xù)多日的實(shí)驗(yàn)期間，即使盒子完好，蛋白也可能會(huì)展開(kāi)、重新折疊、聚合或發(fā)生水解。在最后一個(gè)階段失去蛋白特別令人沮喪。
保持蛋白質(zhì)完整和加快凈化的工具：
處理分泌蛋白
使用分泌蛋白質(zhì)可以避免混亂的溶解過(guò)程。此外，在純化過(guò)程中，蛋白質(zhì)不會(huì)遇到細(xì)胞內(nèi)蛋白酶。無(wú)論蛋白質(zhì)是自然分泌，還是您優(yōu)化了細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，從而在HEK Freestyle或其它優(yōu)化的細(xì)胞系中進(jìn)行純化，您都會(huì)面臨一系列不同的挑戰(zhàn)。例如，必須從量相對(duì)較大的上清液中分離出完整的細(xì)胞，并且必須濃縮蛋白樣品。
分離、透析和濃縮分泌蛋白的工具：
快速獲取有關(guān)細(xì)胞的真知灼見(jiàn)
如果細(xì)胞培養(yǎng)工作流程的目的是提供細(xì)胞生理上的相關(guān)信息，則需要正確的工具來(lái)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像和分析。最好的工具可提供可復(fù)制和信息豐富的分析，以幫助您快速洞悉結(jié)果并采用具有成本效益的方式公布結(jié)果。
細(xì)胞增殖
增殖是正常組織發(fā)育、再生和更新的基本機(jī)制。三種主要的生化細(xì)胞增殖試驗(yàn)是基于DNA合成、代謝活動(dòng)和ATP濃度，通常是結(jié)合在一起的單終點(diǎn)試驗(yàn)，以提供時(shí)間過(guò)程數(shù)據(jù)。這些終點(diǎn)測(cè)量屬于間接方法，并且容易受到無(wú)法通過(guò)形態(tài)變化輕易驗(yàn)證的偽影的影響。
通過(guò)活體細(xì)胞成像，在培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)進(jìn)行細(xì)胞增殖試驗(yàn)，如：無(wú)標(biāo)簽融合測(cè)量和使用熒光標(biāo)記的直接細(xì)胞計(jì)數(shù)。
細(xì)胞凋亡
細(xì)胞凋亡是正常組織發(fā)育和內(nèi)穩(wěn)態(tài)的一個(gè)重要過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中細(xì)胞會(huì)及時(shí)發(fā)生程序性死亡。常用的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法包括使用酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)caspase-37激活或PS外化的酶檢測(cè)方法。這些常見(jiàn)的檢測(cè)方法可得出單一的、用戶定義的終點(diǎn)測(cè)量結(jié)果，需要多個(gè)清洗步驟或細(xì)胞提升從而可能導(dǎo)致偽影，并且這些方法不適合長(zhǎng)期測(cè)量，因?yàn)楸尘靶盘?hào)會(huì)隨著時(shí)間的推移而增強(qiáng)。
活細(xì)胞分析允許使用專用試劑同步、實(shí)時(shí)測(cè)量多種凋亡通路。然后，凋亡信號(hào)可以與相襯圖像相關(guān)聯(lián)，提供凋亡細(xì)胞死亡相關(guān)的其他生物學(xué)見(jiàn)解和形態(tài)學(xué)驗(yàn)證。
細(xì)胞毒效應(yīng)
細(xì)胞毒性是一個(gè)籠統(tǒng)的術(shù)語(yǔ)，描述了物質(zhì)或環(huán)境變化對(duì)細(xì)胞健康的有害影響，這些影響可能危及代謝活動(dòng)、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或分裂，或最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
許多細(xì)胞毒性試驗(yàn)涉及到細(xì)胞膜完整性的測(cè)定，即使用無(wú)法滲透至健康細(xì)胞的染料，或者通過(guò)釋放死亡細(xì)胞標(biāo)記物的方式。此外，代謝活動(dòng)測(cè)量也被用來(lái)測(cè)定細(xì)胞毒性。然而，這些試驗(yàn)很少涉及隨著時(shí)間的推移直接對(duì)死亡細(xì)胞的計(jì)數(shù)。
活細(xì)胞分析允許使用專用試劑實(shí)時(shí)測(cè)定基于細(xì)胞膜完整性的凋亡通路。死亡細(xì)胞的細(xì)胞核吸收一種被活細(xì)胞排除在外的惰性染料，熒光信號(hào)隨著時(shí)間的推移而增強(qiáng)，從而識(shí)別出死亡細(xì)胞。然后，細(xì)胞毒性信號(hào)可以與相襯圖像相關(guān)聯(lián)，提供凋亡細(xì)胞死亡相關(guān)的其他形態(tài)學(xué)驗(yàn)證。
