用于活細胞分析的 Incucyte^? Akt 激酶檢測

Akt 激酶檢測概述

激酶信號在耦合外部刺激以改變下游生理功能（例如健康細胞代謝、增殖和存活）的過程中具有至關(guān)重要的意義。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路失調(diào)與癌癥的發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)相關(guān)。Akt 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在多種癌癥類型中其表達均有所上調(diào)，該激酶與細胞的異常生長、凋亡和代謝具有機制相關(guān)性，因此它已在廣泛研究中被用作腫瘤治療的靶點。

Akt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)抑制劑已顯示出作為單藥治療的臨床前景，或可與常規(guī)化療藥物聯(lián)用以提高癌癥的治療效果。由于測定激酶活性標(biāo)準(zhǔn)方法的局限性，識別上述抑制劑頗具挑戰(zhàn)。研究激酶活性的動態(tài)變化尤為困難，且缺少在相關(guān)生理環(huán)境中測定活細胞變化的分析方法。

使用傳統(tǒng)方法研究激酶活性較為困難，原因如下：

過程繁瑣，需手動進行樣品制備
終點分析測量局限于單個時間點
無法監(jiān)測同一細胞的多次處理效果
由于通量有限，待研究的樣本數(shù)受限

借助 Incucyte^? Akt 激酶檢測，研究人員可在生理相關(guān)環(huán)境下測定和分析活細胞中 Akt 活性的動態(tài)變化，并結(jié)合蛋白激酶活性的長期評估和對細胞增殖的影響，進一步深入了解處理效果。

應(yīng)用

Incucyte^? Akt 激酶綠色/紅色慢病毒試劑可高效、無干擾且均勻地標(biāo)記哺乳動物細胞，用于 Akt 激酶活性動態(tài)變化的體外分析。這種慢病毒試劑是一種基因編碼傳感器，基于綠色熒光蛋白標(biāo)記的 Akt 底物，底物的亞細胞定位呈磷酸化依賴性，由紅色熒光蛋白標(biāo)記的核標(biāo)記物指示核/細胞質(zhì)邊界。

底物被 Akt 磷酸化后，綠色熒光傳感器將從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)。抑制 Akt 可阻止傳感器磷酸化，使傳感器保留在細胞核內(nèi)。本分析方案提供了一種有效的解決方案，可在生理相關(guān)環(huán)境下測定和分析活細胞中 Akt 活性的動態(tài)變化。

關(guān)鍵優(yōu)勢

新型無干擾試劑– Incucyte^? Akt 激酶慢病毒試劑可在多種細胞類型中表達穩(wěn)定的基因編碼的激酶活性報告物
提高分析效率?- 縮小單一靶向生化檢測和后續(xù)低通量細胞實驗的差距，確定新型治療方法
Akt活性的時效研究- 通過靈活檢測活細胞中 Akt 活性隨時間的動態(tài)變化，開啟研究新視角
同時進行細胞計數(shù)-?在同一實驗中進行 Akt 激酶活性定量和增殖分析

新型無干擾試劑

Incucyte^? Akt 激酶慢病毒試劑可在多種細胞類型中表達穩(wěn)定的基因編碼的激酶活性報告物，從而監(jiān)測活細胞中 Akt 激酶活性隨時間的變化。

圖 1.測量化合物對活細胞中 Akt 活性的影響。使用 Akt 選擇性抑制劑 MK2206 處理可穩(wěn)定表達 Incucyte^? Akt 激酶綠色/紅色指示劑的 SK-OV-3 細胞，使綠色熒光傳感器從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核。如左側(cè)的動力學(xué)圖表所示，核轉(zhuǎn)位比率隨時間推移而下降，表明 Akt 具有抑制作用。頂部的圖中顯示了相位和紅色熒光圖像通道，底部的圖中顯示了綠色熒光通道。可以看到，綠色熒光傳感器在 28 分鐘內(nèi)從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核中，而紅色熒光核標(biāo)記物的位置沒有變化。

提高分析效率

通過在 96 孔板中評估多種化合物或處理方法提高分析效率，可縮小單一靶向生化檢測和后續(xù)低通量細胞實驗的差距，確定新型治療方法。

圖 2.在單個 96 孔板中，使用活細胞動力學(xué)數(shù)據(jù)評估多種化合物 Akt 活性的時間依賴性效應(yīng)。?將穩(wěn)定表達 Incucyte^? Akt 激酶綠色/紅色指示劑的 A549 細胞以 5000 個細胞/孔的密度接種到 96 孔板中。使用靶向 PI3K/Akt 激酶通路的抑制劑處理細胞，包括變構(gòu) Akt 抑制劑 MK2206 和 API-1、Akt 競爭性抑制劑 AZD5363 和 Ipatasertib，以及上游 PI3K 激酶抑制劑 LY294002 和 PI-103。如 96 孔板視圖（左）所示，在所有測定的化合物中，核轉(zhuǎn)位比率 (NTR) 呈時間和濃度依賴性下降，表明 Akt 具有抑制作用。AZD5363 和 LY294002 24 小時的 NTR 動力學(xué)圖表（中間圖）顯示了不同的動力學(xué)曲線。添加 AZD5363 會在 24 小時內(nèi)對 Akt 產(chǎn)生持續(xù)抑制，而添加 PI3K 抑制劑 LY294002 會導(dǎo)致 NTR 的短暫下降，然后恢復(fù)至基線，表明 Akt 重新激活。 IC50 曲線（右圖）顯示在時間點 1.5 h 和 25 h 的數(shù)據(jù)。

Akt 活性的長期研究

通過活細胞中 Akt 活性的短期和長期動態(tài)變化的持續(xù)、靈活檢測，開啟研究新視角。自動測定并直觀顯示 Akt 的抑制作用，可獲得任何時間點的動力學(xué)數(shù)據(jù)。

圖 3.觀察血清饑餓和 Akt 激活的影響隨時間的變化。將可穩(wěn)定表達 Incucyte^? Akt 激酶綠色/紅色指示劑的 HeLa 細胞轉(zhuǎn)移到不含血清的培養(yǎng)基中，清除已知的可激活 PI3K/Akt 激酶通路的各種生長因子。血清轉(zhuǎn)移導(dǎo)致核轉(zhuǎn)位比率 (NTR) 降低，提示 Akt 活性下降，但在保存于 10% 血清中的對照孔中沒有觀察到變化。 4 小時后，用 1.1 ng/mL 表皮生長因子 (EGF) 或 3.3 nM R3-IGF-1（一種胰島素樣生長因子的重組類似物）處理細胞。 NTR 的快速增長表明 Akt 被兩種化合物誘導(dǎo)激活。 R3-IGF-1 加入后，可在 12 小時內(nèi)持續(xù)激活 Akt，而 EGF 的激活作用隨時間而減弱。圖中顯示了所有條件下生成的代表性圖像。加入化合物前，傳感器位于不含血清的培養(yǎng)基中的細胞核和 10% 血清中對照細胞的細胞質(zhì)中 (3 h)。 EGF 或 R3-IGF-1 激活 Akt 后，傳感器會從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì) (4.5 h)。 ?在 EGF 處理的細胞中，Akt 的活性隨時間降低，傳感器回到細胞核，但在 R3-IGF-1 處理的細胞中，傳感器仍在細胞質(zhì)中 (12 h)。

同時進行細胞計數(shù)

在同一實驗中進行 Akt 激酶活性定量和增殖分析。在同一細胞群中研究 Akt 的抑制作用對癌細胞增殖的影響。

圖 4.在同一實驗中同時進行 Akt 活性測定和細胞增殖分析。將表達 Incucyte^? Akt 激酶綠色/紅色指示劑的 MDA-MB-231 和 T-47D 細胞分別以 2500 和 4000 個細胞/孔的密度接種到 96 孔板中。使用選擇性 Akt 抑制劑 (MK2206) 和蛋白質(zhì)合成抑制劑（環(huán)己酰亞胺）處理細胞后，可在同一細胞中同時監(jiān)測核轉(zhuǎn)位比率 (NTR)，用于測量 Akt 活性，以及紅色熒光計數(shù) (Red Object Counts)，用于測量細胞增殖。NTR 動力學(xué)圖表（上排）顯示，在兩個細胞系中，MK2206 對 Akt 產(chǎn)生濃度依賴性抑制。對同一細胞進行紅色熒光計數(shù)（中排），結(jié)果表明，MK2206 對 Akt 的抑制對兩個細胞系的增殖具有不同的影響，MK2206 對 T-47D 細胞產(chǎn)生濃度依賴性抑制，但對 MDA-MB-231 細胞幾乎沒有影響。在兩個細胞系中，環(huán)己酰亞胺處理對細胞增殖有抑制作用，但未影響 Akt 活性。下排圖中顯示了紅色熒光計數(shù)的 IC50 圖表 (24 h) 及核轉(zhuǎn)位比率 (72 h)。在兩種細胞類型中，通過 NTR 測定 Akt 抑制的 IC50 相同，但與 MDA-MB-231 細胞相比，T-47D 細胞中紅色熒光計數(shù)的 IC50 明顯向左偏移。