分化確認(rèn)。監(jiān)測永生化 THP-1 細(xì)胞和血源性原代單核細(xì)胞在分化過程中的形態(tài)學(xué)變化。 THP-1 細(xì)胞暴露于 5 ng/mL PMA 48 小時后分化成 M0 巨噬細(xì)胞。原代單核細(xì)胞在 50 ng/mL GM-CSF 中培養(yǎng) 6 天后，在 1 ng/mL LPS + 20 ng/mL IFN-γ 中繼續(xù)培養(yǎng)一天后可分化成類-M1 表型的細(xì)胞，或在 50 ng/mL M-CSF 中培養(yǎng) 6 天，然后在 20 ng/mL IL-4 中繼續(xù)培養(yǎng)一天后分化成類-M2 表型的細(xì)胞。注意細(xì)胞形態(tài)與之前研究中的發(fā)現(xiàn)一致 (Young et al, J Immunol, 1990)；M1 細(xì)胞群呈現(xiàn)煎蛋形態(tài)，M2 細(xì)胞群為煎蛋形態(tài)和梭形細(xì)胞的混合形態(tài)。

分化過程跟蹤。相位圖中顯示了人 iPSC-源性單核細(xì)胞（0-7 天）分化中的形態(tài)。該細(xì)胞最終產(chǎn)生分化的人 iPSC-源性巨噬細(xì)胞（含有大囊泡）。加入 100 ng/mL M-CSF 以維持培養(yǎng)基至少 7 天，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分化。

對形態(tài)和細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行可視化處理用于研究細(xì)胞分化情況。在CD11b、CD14 或 CD40 ?復(fù)合Incucyte^? Fabfluor-488 抗體存在的情況下，將 THP-1 單核細(xì)胞暴露于培養(yǎng)基（未分化）、維生素 D3 或 PMA 中。與培養(yǎng)基單獨(dú)處理或維生素 D3 處理的細(xì)胞相比，PMA 處理后細(xì)胞形態(tài)顯示出明顯的變化（高清相差圖片）。動態(tài)圖突出顯示了不同處理條件下，細(xì)胞表面蛋白表達(dá)的差異性和時間依賴性。

單核細(xì)胞成熟的生物學(xué)意義。將 THP-1 細(xì)胞（初始型或 PMA 誘導(dǎo)分化的 M0 細(xì)胞）接種到涂覆有纖連蛋白的 ClearView 趨化性膜上。然后，將細(xì)胞暴露于 C5a 梯度中，使用 Incucyte^?系統(tǒng)每小時采集一次圖像。在 t = 30 h 時進(jìn)行藥理學(xué)反應(yīng)分析。分化后的類巨噬細(xì)胞 THP-1 細(xì)胞對 C5a 有很強(qiáng)的濃度依賴性反應(yīng)，分化前 THP-1 對 C5a 產(chǎn)生較弱的反應(yīng)，或未觀察到反應(yīng)。

巨噬細(xì)胞趨化性動態(tài)監(jiān)測的重要性。原代血單核細(xì)胞分化為類-M2 表型；培養(yǎng)環(huán)境為 50 ng/mL M-CSF 中培養(yǎng) 6 天，然后在 20 ng/mL IL-4 中繼續(xù)培養(yǎng)一天。巨噬細(xì)胞接種到涂覆有 Matrigel 的 ClearView 趨化性膜上，然后暴露于 C5a 梯度中，使用 Incucyte^?系統(tǒng)每 2 小時采集一次圖像。進(jìn)行底部相位分析，并在 4.5 h 和 11 h 時進(jìn)行藥理學(xué)反應(yīng)測定。注意，在較高濃度下，由于響應(yīng)延遲，C5a 效價發(fā)生了顯著的時間依賴性變化，這是一種特異性反應(yīng)，在中性粒細(xì)胞中未觀察到此類反應(yīng)。

吞噬作用的定量分析。iPSC 源巨噬細(xì)胞 (Axol Bioscience) 以時間和細(xì)胞數(shù)量依賴性方式吞噬 Incucyte^? pHrodo^? Green E. coli Bioparticles^? 染料偶聯(lián)物。 ?每個孔中有 100 μg pHrodo^? Green E. coli Bioparticles^?，iPSC 源巨噬細(xì)胞的相差和熒光融合圖像顯示了隨時間的推移 Bioparticles^? 的被細(xì)胞攝取的情況。 ?在每張圖像下方是相應(yīng)的 masked-image，強(qiáng)調(diào)使用分割來完全定量吞噬作用動力學(xué)。 ?iPSC 源巨噬細(xì)胞使用單一 pHrodo^? Green E. coli Bioparticle（100 μg/孔）獲得的吞噬作用時間進(jìn)程曲線呈現(xiàn)出細(xì)胞數(shù)量依賴性。

抗-CD47 誘導(dǎo)的 CCRF 細(xì)胞吞噬作用。標(biāo)記的 CCRF-CEM 細(xì)胞經(jīng)濃度遞增的抗-CD47 抗體 (B6H12.2) 處理后，加入到人骨髓源巨噬細(xì)胞中（BMDM；數(shù)值表示為平均值 ± SEM，n = 4）。

巨噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞的成像和定量。J774.A1 巨噬細(xì)胞內(nèi)吞噬的 Jurkat 細(xì)胞顯示出高熒光強(qiáng)度，與細(xì)胞吞噬量成比例。以 2 分鐘為間隔快速成像可制作個體吞噬事件的視頻。

分化決定吞噬能力。THP-1 細(xì)胞暴露于 200 nM PMA 24 小時、暴露于 200 nM PMA 中 24 小時 + 20 ng/mL IFNγ + 1 μg/mL LPS，或暴露于 200 nM PMA 中 24 小時 + 20 ng/mL IL-4，分別分化為 M0、M1 或 M2 巨噬細(xì)胞。然后，將細(xì)胞與 pHrodo Red 標(biāo)記的凋亡 Jurkat 細(xì)胞共培養(yǎng)，利用被吞噬的 Jurkat 細(xì)胞的熒光信號評價分化的巨噬細(xì)胞的吞噬能力。數(shù)據(jù)顯示，分化為 M0 和 M2 的 THP-1 細(xì)胞有顯著更高的吞噬能力，該結(jié)果與 M2 巨噬細(xì)胞的抗炎功能一致。