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使用實時活細胞分析檢測中性粒細胞的功能

中性粒細胞處于感染位點防御的第一線,通過攝取細菌和釋放抗菌酶來降解和殺死病原體,在先天免疫系統(tǒng)中扮演著重要的角色。中性粒細胞的招募和功能對于宿主防御至關(guān)重要,但也會誘發(fā)炎癥,導致阿爾茨海默癥和類風濕關(guān)節(jié)炎等疾病的進展。

Incucyte? 活細胞分析系統(tǒng)已用于在趨化實驗中評估中性粒細胞對趨化因子的響應,以及通過體外 NETosis、吞噬作用和分化實驗評估細胞的功能。

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中性粒細胞應用

趨化的定量分析

檢測相關(guān)表面接觸介導的細胞遷移。ClearView 薄膜的低孔隙密度可確保細胞通過生物性相關(guān)表面向趨化因子遷移。在無涂覆的 ClearView 薄膜上接種的中性粒細胞無法向趨化因子?IL-8 和 fMLP 遷移(左圖);但是在涂覆有 Matrigel 的薄膜上,中性粒細胞顯示出清晰的趨化性曲線(右圖)。這些數(shù)據(jù)表明,在該模型中,整合素和/或細胞表面受體與底物的相互作用對于中性粒細胞的趨化性具有關(guān)鍵作用。相比之下,使用 Corning? Transwell? 耗材(未顯示數(shù)據(jù))研究中性粒細胞的遷移則不需要涂覆,這表明 Corning? Transwell? 系統(tǒng)中,中性粒細胞不存在穿過 Transwell? 過濾器的活性遷移。

NETosis 的可視化和定量分析

NETosis 的可視化和定量分析。用 DMSO (1.25% v/v) 和 ATRA (0.1 μM) 將 HL-60 細胞分化為中性粒細胞型。用 PMA 刺激獲得的多核 dHL-60 細胞。在刺激后大約 2 小時,細胞核開始解聚。高清相位圖和熒光圖顯示了中性粒細胞 NETosis 的特異性形態(tài),當細胞質(zhì)和核質(zhì)的混合時,細胞核在相位圖中不再可見。細胞核內(nèi)容物被轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜上并釋放出來。

動力學數(shù)據(jù)顯示,通過 Incucyte? Cytotox 綠色染料與外部 DNA 的結(jié)合,檢測到 PMA 誘導的中性粒細胞 NETosis 死亡。

吞噬作用的定量分析

分化決定吞噬作用的能力。HL-60 細胞經(jīng) 0.1 μM atRA 和 1.2% DMSO 處理 5 天后分化成中性粒細胞。然后將細胞接種,并加入 Incucyte? pHrodo? 綠色熒光顆粒。 然后對分化的 HL-60 細胞的吞噬能力進行評估。數(shù)據(jù)顯示,原始和分化的 HL-60 細胞的吞噬能力有顯著的不同,分化細胞的熒光面積大幅增加,表明產(chǎn)生了吞噬作用。

原代中性粒細胞的吞噬作用。將從外周血液中提取的原代中性粒細胞進行接種,并加入 Incucyte? pHrodo? 綠色熒光顆粒。 原代中性粒細胞具有高度吞噬性,它們吞噬生物顆粒,使熒光信號增強。

分化監(jiān)測

分化過程跟蹤。相位圖顯示了在 RPMI + 10% 胎牛血清培養(yǎng)基中加入 1.25% DMSO 和 1 μM ATRA 的培養(yǎng)條件下,未分化的 HL-60 細胞和分化為中性粒細胞樣的 HL-60 細胞的形態(tài)差異。動力學數(shù)據(jù)顯示了細胞增殖的差異(高清相位匯合度檢測)。

監(jiān)測細胞形狀的變化

PMN 細胞形狀(偏心率)的變化。將來自全血的 PMN 接種到 Matrigel 中,其中含有 Incucyte??FabFluor-488 標記的 CD11b 抗體和 Opti-green 背景抑制因子,以及濃度遞增的 CSCL8,在 Incucyte? 活細胞分析系統(tǒng)中成像,獲取相位和綠色熒光圖像。使用 Incucyte? Cell-by-Cell 分析軟件定量細胞形狀的變化以及 CD11b 表達隨時間的變化。

參考文獻

參考文獻

NETosis; Gupta et al 2017. J Immunol. 2017 Dec 1. pii: ji1700905. doi: 10.4049/jimmunol.1700905.?

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