Incucyte^? CytoATP 慢病毒試劑適用于多種細(xì)胞類型，可直接測量活細(xì)胞中的胞質(zhì) ATP。

圖 1. 對活細(xì)胞進(jìn)行高效、無干擾的標(biāo)記，能夠直接測量胞質(zhì) ATP。

用 Incucyte^? CytoATP 慢病毒感染 HeLa 細(xì)胞并進(jìn)行嘌呤霉素篩選以得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞群。與親代細(xì)胞相比，表達(dá) CytoATP 的細(xì)胞的形態(tài) (A) 和增殖 (B) 無變化。(C) 將穩(wěn)定表達(dá) CytoATP 的 HeLa 細(xì)胞以 4,000 個(gè)細(xì)胞/孔接種到 96 孔微孔板中，并用 2-脫氧-D-葡萄糖 (2DG) 和氰化鉀 (KCN) 進(jìn)行聯(lián)合處理。對 3 小時(shí)內(nèi)捕獲的 CytoATP 熒光圖像進(jìn)行定量，結(jié)果顯示，由于同時(shí)發(fā)生糖酵解和氧化磷酸化阻斷而導(dǎo)致 ATP 呈濃度依賴性快速耗竭。

圖 2. 在單一培養(yǎng)或先進(jìn)的細(xì)胞模型中區(qū)在分特定細(xì)胞類型中對 ATP 的影響。在存在或不存在 CCD14086SK 成纖維細(xì)胞的條件下，接種三陰性乳腺癌 (TNBC) 細(xì)胞系 HCC1806 和穩(wěn)定表達(dá) CytoATP 或 CytoATP 非結(jié)合對照的受體陽性乳腺癌細(xì)胞系 MCF7（8000 個(gè)細(xì)胞/孔）。使用集成式 Incucyte^? ATP 分析軟件模塊鑒別 ATP 的細(xì)胞變化（色標(biāo)遮蔽）。遮蔽后的圖像 (A) 提供了在單一培養(yǎng)物以及與 CCD14086SK 細(xì)胞的共培養(yǎng)物中經(jīng) 1 μM CB-839 處理的 HCC1806 細(xì)胞中 ATP 的可視化。動力學(xué)數(shù)據(jù)顯示，與單一培養(yǎng)物中生長的 MCF-7（受體陽性細(xì)胞系）(C) 相比，CB-839 處理后 TNBC 細(xì)胞系中 ATP 的耗竭更持久 (B)。然而，與基質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)物介導(dǎo)了 TNBC 細(xì)胞中對 CB-839 的抗性，而受體陽性細(xì)胞系則未表現(xiàn)出不同的影響。IC50 曲線顯示出時(shí)間點(diǎn) 72 h (B) 和 15 h (C) 的數(shù)據(jù)。

生成實(shí)時(shí)代謝數(shù)據(jù)，以便更深入地了解對治療產(chǎn)生響應(yīng)的短期和長期 ATP 動力學(xué)。

圖 3. 通過對 ATP 進(jìn)行無損、重復(fù)測量，區(qū)分有絲分裂毒性化合物與細(xì)胞毒性化合物。穩(wěn)定表達(dá) CytoATP 或非結(jié)合對照的 NIH 3T3 細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)條件（葡萄糖）或含有替代葡萄糖的半乳糖的生長培養(yǎng)基（半乳糖）中生長，以推動能量代謝對氧化磷酸化的依賴。在 96 孔微孔板中以 12,000 個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種細(xì)胞，并用無毒化合物（安貝生坦）、細(xì)胞毒性化合物（氯丙嗪）或有絲分裂毒性化合物（奈法唑酮）進(jìn)行處理的熒光圖像（10 倍）。動力學(xué)數(shù)據(jù)顯示，在經(jīng)細(xì)胞毒性或有絲分裂毒性化合物處理的細(xì)胞中，ATP 迅速耗竭。雖然在兩種培養(yǎng)基條件下對細(xì)胞毒性化合物的響應(yīng)相似，但是在半乳糖中生長的細(xì)胞中，奈法唑酮的 IC50 向左偏移，表明存在線粒體毒性。在早期時(shí)間點(diǎn)觀察到更高的分離度，表明動力學(xué) CytoATP 數(shù)據(jù)有助于更深入地評價(jià)化合物特征。

將細(xì)胞形態(tài)的變化與 ATP 代謝相關(guān)聯(lián)，以揭示細(xì)胞行為的信息、時(shí)間變化。

圖 4. 使用 HD 相圖，能夠?qū)?xì)胞形態(tài)進(jìn)行定性檢查。將穩(wěn)定表達(dá) CytoATP 或非結(jié)合對照的 HeLa 細(xì)胞以 2000–8000 個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到 96 孔微孔板中，用氯丙嗪 (60 μM)、依托泊苷 (100 μM) 或 2DG (20 mM) + KCN (2 mM) 進(jìn)行處理，這些化合物耗竭 ATP 且效應(yīng)隨時(shí)間變化，如動力學(xué)結(jié)果所突出顯示的（插圖）。在耗竭過程中采集的細(xì)胞 HD 相圖（10 倍）顯示，與溶媒對照相比，經(jīng)氯丙嗪 (21 h) 和依托泊苷 (75 h) 處理的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了巨大變化，而經(jīng) 2DG + KCN (60 min) 處理的細(xì)胞則未表現(xiàn)出顯著的形態(tài)變化。

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